Изучение микробиома кишечника собак при скармливании пробиотика Профорт®

УДК 636.043 (470.53)

Дуняшев Тимур Петрович, к.с-х.н., специалист молекулярно-генетической лаборатории, ветеринарный консультант timur@biotrof.ru
Ромадина Татьяна Николаевна, ветеринарный врач, rtn@biotrof.ru
Тюрина Дарья Георгиевна, к.э.н., заместитель директора по финансам
Ильина Лариса Александровна, к.б.н., доцент, начальник молекулярно-генетической лаборатории

ФГБОУ ВО СПбГАУ (г. Санкт-Петербург)
ООО «БИОТРОФ» (г. Санкт-Петербург)

Собаки заняли особое положение в жизни человека, став нашими главными животными-компаньонами.  Усилия по обеспечению их здоровья и благополучия резко возросли, и в последнее время растет интерес к оценке влияния кишечной микробиоты на здоровье собак. Недавние технологические достижения создали новые инструменты не только для изучения микробного состава кишечника собак, но и для тщательного изучения генетического потенциала и связанных с ним метаболических функций этого микробного сообщества [6]. 

Многие владельцы собак, выезжая на летние месяцы в пригороды, берут своих питомцев. При переезде возникает множество волнующих собаку событий, а так же воздействие на ее организм абиотических и биотических факторов среды, что в свою очередь ведет к расстройству пищеварения, доставляя множество хлопот и беспокойства владельцам животного[4].

Важнейшими факторами, оказывающими влияние на процессы переваривания и усвоения пищи являются микрофлора пищи, и микрофлора пищеварительной системы [3, 4]. Пробиотики используют для профилактики и лечения желудочно-кишечных инфекций и расстройств пищеварения, возникших по причине нарушения правил кормления, стрессов, резкой смены рациона, после антибиотикотерапии, при этом  причиной редкого использования пробиотиков являются низкая эффективность многих из них, и некорректный подбор штаммов микроорганизмов применительно к собакам [2]. Ввиду вышеизложенного, научный и практический интерес для собаководства в условиях городской среды имеют многофункциональные кормовые добавки, комплексного действия, сочетающие в себе качества фермента и пробиотика.

Материалы и методы. Работа выполнена в лаборатории компании ООО «БИОТРОФ» (г. Санкт-Петербург). В ходе исследований нами были изучены особенности изменения микрофлоры желудочно-кишечного тракта собак в условиях городской среды при использовании многофункциональной кормовой добавки Профорт® производства ООО «БИОТРОФ». Профорт® – кормовая пробиотическая добавка для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта и нормализации процессов пищеварения у животных, с содержанием в 1г кормовой добавки живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 не менее 1,0х10⁷ КОЕ, и Enterococcus faecium 1-35 не менее 1,0х10⁷ КОЕ [1]. Для исследований были подобраны собаки (n=6), которым вместе с основным рационам скармливали пробиотик Профорт®в количестве 0,05 г на голову в сутки (табл. 1).  Продолжительность опыта составила 21 день.  Пробы содержимого кишечника собак отбирали в 1 (контроль), 7, 14 и 21-е сутки для исследования микробного сообщества молекулярно-генетическими методами. Исследования микробиоты кишечника проводили в лаборатории компании ООО «БИОТРОФ» (г. Санкт-Петербург) с применением NGS-анализа (Next Generation Sequencing) для определения структуры (процентного содержания) компонентов бактериального сообщества. Они позволяют детектировать и определять содержание низко представленных микроорганизмов в кишечном сообществе.

В данной работе мы выполнили молекулярно-генетические исследования методом NGS – секвенирования содержимого кишечника собак. Выделение тотальной ДНК для проведения молекулярно-биологических анализов осуществляли согласно методике, описанной в Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1984), Ильиной (Ильина, 2013) и Ушаковой с соавторами (Ушакова и др., 2013), в собственной модификации. Тотальную ДНК из исследуемых образцов выделяли с использованием набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas, Inc.», Литва) следуя рекомендациям производителя. Концентрацию полученной ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit

(«Invitrogen, Inc.», США) с использованием наборов «Quant-iT dsDNA Broad-Assay Kit» («Invitrogen, Inc.», США), согласно рекомендациям производителя. Амплификацию для последующего проведения NGS-секвенирования проводили с использованием ДНК-амплификатора Verity («Life Technologies, Inc.»,США) с помощью эубактериальных праймеров (IDT), 343F CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3’) и 806R (5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’), фланкирующих участок V1V3 гена 16S рРНК. Метагеномное секвенирование осуществляли на геномном секвенаторе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с набором MiSeq Reagent Kit v3 («Illumina, Inc.», США). Максимальная длина полученных последовательностей составила 2 х 300 нт. Химерные последовательности были исключены из анализа с помощью программы [9]. Обработка полученных ридов 2 х 300 пар нуклеотидов происходила с помощью биоинформатической платформы «CLC Bio GW 7.0» («Qiagen», Нидерланды) и включала в себя перекрывание, фильтрацию по качеству (QV>15), триммирование праймеров.

Результаты исследований. Результаты исследований показали, что при применении кормовой добавки Профорт® наблюдается изменение в микрофлоре пищеварительной системы клинически здоровых собак. Бактериальное разнообразие представлено в основном пятью таксонометрическими типами: Firmicutes, Fusobacteria, Bacteroidetes, Proteobacteria и Actinobacteria. Растительная пища является обязательным компонентом рациона необходимым для формирования нормальной флоры кишечника собаки, однако такой компонент корма сложно переваривается из-за тяжело растворимой клетчатки. Целлюлозолитические бактерии расщепляют клетчатку в рационе. Поддержание в пределах нормы их количества, а также увеличение их концентрации, является важной задачей в кормлении собак. Как показало исследование концентрация целлюлозолитических бактерий к 7-м суткам опыта увеличилась в 2,5 раза за счет высокого содержания семейства Lachnospiraceae (41,1%). К 14 суткам доля целлюлозоитиков незначительно снижается до 40,43%, а к 21 суткам их концентрация составляет лишь 28,5%, что говорит о границах оптимального ввода в рацион пробиотика Профорт® (до 14 суток).  Бактерии семейства Veillonellaceae обладают способностью трансформировать органические кислоты до летучих жирных кислот (например, бутирата), принимая активное участие в процессе метаболизма. К 21-м суткам концентрация ЛЖК-синтезирующих микроорганизмов выросла в 13,3 раза, что свидетельствует о сохранении оптимального pH в желудке собак и, как итог, о правильном пищеварении (табл. 1.).

Микроорганизмы	1 сутки контрольная	7 суток Профорт®	14 суток Профорт®	21 сутки Профорт®
Сем. Ruminococcaceae	0,622	0,884	6,329	0,752
Отряд Bacteroidales	1,105	1,476	2,567	2,022
Сем. Lachnospiraceae	9,959	41,121	22,512	23,434
Сем. Eubacteriaceae	0,035	0,082	0,066	0,065
Сем. Flavobacteriaceae	0,009	0,006	0,005	0,015
Сем. Clostridiaceae	7,694	5,608	8,951	2,273
Сумма целлюлозолитиков	19,424	49,177	40,43	28,561
Отряд Bacillales	0,049	0,039	0,055	0,026
Отряд Lactobacillales	0,258	0,164	0,173	0,18
Отряд Bifidobacteriales	0,02	0,014	0,024	0,028
Сем. Veillonellaceae	1,785	0,357	22,736	21,58

Результаты исследования условно-патогенной микрофлоры представлены в таблице 2. В проведенном опыте установлено, что доля условно-патогенной кишечной палочки (Escherichia/Shigella) резко снижается при введении в рацион пробиотика Профорт®. Так, на 7-е сутки применения кормовой добавки, концентрация данных микроорганизмов снизилась в 46,6 раз. Полезные бактерии, входящие в состав пробиотика Профорт® «вытеснили» условно-патогенную кишечную палочку, опустив ее концентрацию практически до нуля. Высокое количество данных микроорганизмов может вызывать у собак болезни ЖКТ, например, гастроэнтерит, энтерит.

Микроорганизмы	1 сутки контрольная	7 суток Профорт®	14 суток Профорт®	21 сутки Профорт®
Вид Escherichia/Shigella	14,194	0,394	0,255	0,186
Сем. Actinomycetaceae	0,015	0,004	0,001	0,001
Вид Actinomyces_canis	0,003	0	0	0

Как известно, наличие в ЖКТ животных патогенной микрофлоры свидетельствует о наличии или возможном возникновении заболеваний различных этиологий. В нашем исследовании был обнаружен ряд патогенов, опасных для здоровья собак (Табл. 3). Виды Fusobacteriaceae, наиболее часто встречаются при инфекциях, в частности преобладает Fusobacterium mortiferum в клинических образцах содержимого кишечника собак и часто ассоциируется с оральными, легочными и внутричерепными инфекциями. В нашем исследовании концентрация патогенного вида Fusobacterium mortiferum имела тенденцию к постепенному снижению к 21 суткам, что говорит о положительном влиянии пробиотика Профорт® на микрофлору ЖКТ собак. Однако фузобактерии присутствуют в большом количестве в кишечной микробиоте здоровых собак, и его обычное присутствие в ЖКТ других плотоядных животных предполагает, что он не вреден для своего хозяина. Способность фузобактерий расщеплять белки для получения предпочтительных для них субстратов роста, т. е. аминокислот и пептидов, вероятно, является причиной его высокой распространенности у плотоядных животных [8]. Кроме того, не все представители рода Fusobacterium следует рассматривать как потенциально опасные для хозяина. Необходимы специальные экологические исследования в сочетании со сравнительным геномным анализом, чтобы пролить свет на значение высокой численности фузобактерий и ее роль в микробиоте кишечника собак [6-7].Остальные, обнаруженные нами представители патогенной микрофлоры присутствовали в незначительных количествах.

Микроорганизмы	1 сутки контрольная	7 суток Профорт®	14 суток Профорт®	21 сутки Профорт®
Сем. Staphylococcaceae	0,003	0,002	0,004	0,001
Сем. Streptococcaceae	0,034	0,05	0,024	0,046
ВидStreptococcus canis	0	0,004	0,001	0,004
Вид Streptococcus didelphis	0	0	0,002	0,001
Вид Streptococcus orisratti	0,011	0,013	0	0,004
Сем.Brucellaceae	0	0,002	0,001	0,003
Сем.Campylobacteraceae	0,023	0,043	0,024	0
Вид Clostridium perfringens	0,017	0,032	0,006	0,03
Сем.Leptospiraceae	0,003	0,002	0	0
Сем.Mycoplasmataceae	0,006	0	0	0,002
Вид Mycoplasma pulmonis	0,003	0	0	0,001
Род Ehrlichia	0	0,002	0	0
Сем.Fusobacteriaceae	7,048	4,148	2,93	0,247
Вид Fusobacterium mortiferum	4,337	2,441	1,876	0,175
Вид Enterococcus cecorum	0,003	0	0,004	0,004
Вид Enterococcus faecalis	0,003	0	0	0,008
Сем.Listeriaceae	0,003	0,002	0,002	0

Заключение. Результаты исследования показали, что применение многофункциональной кормовой добавки, комплексного действия Профорт® как профилактического средства в период дает положительный результат. Рекомендуется вводить в рацион данный пробиотик в количестве 0,05г на голову в сутки собакам в течение 14 дней, после антибиотикотерапии, при нарушении работы ЖКТ и для общей профилактики возникновения расстройств пищеварения.

STUDYING THE INTESTINAL MICROBIOME OF DOGS WHEN FEEDING THE PROBIOTIC PROFORT®
T.P. Dunyashev, Phd in Agricultural sciences, molecular genetic laboratory specialist, veterinary consultant,timur@biotrof.ru
T.N. Romadina, sales manager, rtn@biotrof.ru
D.G. Tiurina, Phd in Economics, deputy director for finance, tiurina@biotrof.ru
L.A. Ilina, Phd in Biological, assistant professor, head of the molecular genetic laboratory, ilina@biotrof.ru

St. Petersburg agrarian university (Pushkin, Russia)
Ltd «BIOTROF» (Pushkin, Russia)